亨廷顿舞蹈症（HD）研究的热门技术

随着富有创造力的科学家开发出新技术并将其应用于细胞、模型、人类组织和大数据研究，HD 研究正在不断发展。通过与亨廷顿舞蹈症基金会（HDF）——亨廷顿舞蹈症职业晋升资助（HD-CAG）的赞助者——合作，五位研究人员在此分享了他们工作中采用的尖端技术，以及为什么这些创新对于加速发现至关重要。

您的重复序列有多大？

Carlos Chillon-Marinas 和 Sonia Vazquez-Sanchez，加州大学圣迭戈分校 (UCSD)

亨廷顿舞蹈症 (HD) 是由 HTT 基因最前端的一段短 DNA 序列（即 C-A-G 字母）扩增引起的。每个人都携带这种重复序列，区别在于其长度。如果重复次数少于 35 次，通常不会患上 HD。如果超过 40 次，该疾病则是完全外显的。

故事并未随着遗传突变而结束。随着时间的推移，这种重复在某些脆弱的脑细胞内会继续扩增，这种现象被称为体细胞扩增。这一过程目前是 HD 研究的主要焦点，因为它似乎是疾病发作和进展的关键驱动因素之一。超长 C-A-G 扩增与细胞损伤密切相关。

这意味着 HD 不仅仅与一个人继承的重复序列有关；还与该重复序列在大脑内部增长了多少有关。那么，如何测量这些 C-A-G 是如何扩增的呢？

传统上，重复序列长度是使用基于 PCR 的技术测量的。这些方法通过复制 C-A-G 重复 DNA，并根据复制过程中产生的片段来估计重复序列的大小。它们在诊断和中等程度的扩增中表现良好，但在处理极长重复序列时却很吃力。一旦重复序列超过大约 100 次，PCR 往往会失败，从而留下研究中的盲点。

这正是 PureTarget 定向长读长测序技术改变游戏规则的地方。PureTarget 逐个分子地提取整个重复区域，而不会将其破碎成微小片段。然后，利用高保度长读长技术对这些完整的 DNA 分子进行端到端测序。这意味着研究人员不再是估算 CAG 的数量，而是可以在一个连续的片段中，实际读取整个重复区域及其周围 DNA 的精确 DNA 字母代码。重要的是，每个分子都会被多次测序，从而实现高度准确的重复长度测量。

多年来，科学家们一直怀疑体细胞扩增很重要，但我们的工具无法完全捕捉其规模。

其结果是对重复序列生物学有了更清晰的认识：直接测量准确的重复序列长度、重复中断、插入或缺失以及基因拷贝之间的变异，而不是通过推断。这很重要，因为具有相同遗传突变的两个细胞在生命周期中可能会积累截然不同的重复序列长度，这些差异可能是选择性神经元脆弱性的基础。

在一种由 DNA 长度驱动生物学的疾病中，测量扩增的真实大小不仅仅是一个细节。它是了解亨廷顿舞蹈症如何展开的一个新窗口，以及我们未来可能如何减缓它。

多模态空间转录组学：以前所未有的视角观察亨廷顿舞蹈症

Sonia Vazquez-Sanchez 和 Carlos Chillon-Marinas，加州大学圣迭戈分校 (UCSD)

为什么有些脑细胞在 HD 中会死亡，而另一些则保持韧性？几十年来，研究人员一直试图理解其中的原因。

传统工具只能展示故事的片段。我们可以检查亨廷顿蛋白聚集体、测量基因表达或估计 CAG 重复序列的长度——但每个实验都必须单独进行，通常是在许多不同的组织样本中。这意味着我们只能间接地关联结果。我们无法在同一细胞内同时看到所有这些特征，而且我们通常必须在此过程中破坏组织的自然结构。

多模态空间转录组学改变了这一点。

这种新方法基于成像，允许我们在保持组织完整的同时观察单个细胞内部。它依赖于先进的显微镜技术结合复杂的流体系统，能够在同一实验和同一细胞中测量数千个基因的表达水平、CAG 重复序列长度、亨廷顿蛋白聚集体以及 DNA 损伤、压力和神经元身份的信号，同时保持它们的空间背景。

从本质上讲，这项技术让我们能够以细胞级的分辨率观察 HD 的展开。

这项技术的强大之处在于，它将分子事件与 HD 中单个神经元的变化联系起来。我们可以查明哪些细胞最脆弱，并开始了解原因：是因为 CAG 扩增的大小、蛋白质聚集体的存在，还是 DNA 损伤？早期发现表明，重复序列扩增最大的神经元面临的丢失风险最大，而亨廷顿蛋白聚集体似乎与基因活性的转变联系更紧密。这些关系以前是不可见的，因为没有任何单一方法能同时捕捉到所有这些维度。

除了解决长期存在的生物学难题外，多模态空间转录组学还可能有助于指导未来的治疗。通过揭示哪些 DNA 修复途径在脆弱的神经元中处于活跃状态，或者哪些细胞类型显示出最早的压力迹象，研究人员可以对治疗靶点做出更明智的决策。随着技术的不断发展，它有望提供关于 HD 在活体神经回路中如何进展以及我们如何干预的日益详细的视图。

高分辨率细胞图谱

Devon Pendlebury，加州大学欧文分校

冷冻电子断层扫描（cryo-ET）是一种成像技术，允许我们生成细胞内重要特征的 3D 图像。细胞被快速闪冻，有助于保存细胞内部，从而让我们更准确地了解细胞在现实生活中的样子。冷冻后，使用电子显微镜对细胞内部进行成像。电子显微镜比传统的可见光显微镜能看到更多的细节。冷冻样本以多个角度倾斜，并在每个角度拍摄 2D 图像。然后可以将这些图像组合起来创建 3D 重建，使我们能够看到细胞中的区室和蛋白质。

在 HD 研究中，冷冻电子断层扫描技术 (cryo-ET) 已被用于观察细胞中亨廷顿蛋白聚集体的形态，并研究突变亨廷顿蛋白如何影响线粒体。Wah Chiu（斯坦福大学）和 Leslie Thompson（加州大学欧文分校）的实验室利用 cryo-ET 观察了 HD 神经元中的线粒体（细胞的能量工厂）。他们发现 HD 线粒体形状扭曲，并含有健康线粒体中没有的颗粒。该技术还可用于确定治疗方法如何影响线粒体健康。cryo-ET 提供的精细细节使科学家能够识别出其他方法无法检测到的 HD 变化。

这种蛋白质的原力很强大：激光镊子 vs. 亨廷顿蛋白亨廷顿蛋白 这个蛋白是由亨廷顿基因产生的

Piere Rodriguez-Aliaga，斯坦福大学

你还记得《星球大战》、《星际迷航》或《捉鬼敢死队》中，光束捕捉并操纵飞船和怪物的场景吗？该技术在 2018 年获得了诺贝尔物理学奖。光镊是一种单分子“力显微镜”，它使用高度聚焦的激光束来捕捉微小的塑料珠。珠子就像手柄：如果使用分子连接器将蛋白质连接在两个珠子之间，仪器可以通过移动激光陷阱轻轻拉动那 一个 蛋白质分子。在拉动的同时，它能以纳米级的精度测量施加的力和蛋白质延伸的距离。这些力非常微小——通常为几个到几十个皮牛顿（十亿分之一牛顿）——类似于蛋白质在细胞内所经历的力。

这对于亨廷顿蛋白特别有帮助，因为包含多聚谷氨酰胺（polyQ）区域（HD 中变长的蛋白质部分）是不稳定的，会在不同形式之间切换，并且容易发生聚集。

单分子光镊实验通过机械方式一次展开一个亨廷顿蛋白分子，从而避免了这种平均化。通过分析力-伸长曲线和展开/折叠事件的时间，研究人员可以绘制蛋白质的能量图谱和构象。他们可以确定单个蛋白质（单体）表现得像随机线团还是形成瞬时结构，是否存在中间结构，它们的稳定性如何，以及分子在这些结构之间切换的速度。由于测量了许多单个分子，异质性可以直接量化，而不是从数百万个蛋白质的平均值中推断出来。

光镊可以帮助解决 HD 领域一个长期存在的问题：遗传变化是如何使亨廷顿蛋白产生毒性的？研究人员正在使用这种技术来比较具有不同 polyQ 长度的亨廷顿蛋白，并识别可能触发毒性的早期结构变化。他们还在测试翻译后修饰、伴侣蛋白、抗体和候选药物如何重塑亨廷顿蛋白的构象。这种单分子方法可能会揭示新的治疗策略，例如稳定非毒性的亨廷顿蛋白构象。它还可能为筛选治疗方法提供机制读数，并帮助将分子事件与临床相关结果联系起来——展示科幻技术如何解决现实的生物学问题。

让我们把它分拣出来

Chris Kay，奥克兰大学脑研究中心

如果你有一大碗混合糖果，但你只想吃红色的，你会把它们挑出来放在一个单独的盘子里。这正是领先的 HD 研究人员正在使用的一种新技术的思路，该技术旨在研究是什么让某些神经元在 HD 中与众不同，以及为什么它们更容易受到该疾病的影响。荧光激活细胞核分选（简称 FANS）涉及在脑组织样本中为所需的神经元类型贴上微小的荧光标签，然后让该脑样本中的所有细胞通过一个带有摄像头的窄管。每当摄像头检测到带有荧光标签发光的细胞时，它就会被推入一个单独的管中进行收集，而无荧光的细胞则直接通过。经过这个过程，标记的神经元就可以与所有其他脑细胞类型分开进行研究。

这正是领先的 HD 研究人员使用的一项新技术背后的理念，旨在研究 HD 中某些神经元的不同之处，以及为什么它们更容易受到该疾病的影响。荧光激活细胞核分选（简称 FANS）涉及在脑组织样本中为所需的神经元类型贴上微小的荧光标签，然后让该脑样本中的所有细胞通过一个带有摄像头的窄管。每当摄像头检测到带有荧光标签发光的细胞时，该细胞就会被推入一个单独的管中进行收集，而未发光的细胞则直接通过。经过这一过程，标记的神经元就可以与所有其他脑细胞类型分开进行研究。

以这些分选出的神经元作为起始材料，研究 HD 的科学家已经应用了许多尖端技术来研究它们的独特之处。这就是这种新型 FANS 技术如此强大的原因——一旦神经元被分选和分离，研究人员就可以使用各种工具和方法以许多不同的方式对它们进行分析。例如，一些研究已经表明，HD 中受影响最严重的神经元具有更多的体细胞 CAG 扩增。许多试图阻断体细胞扩增以治疗 HD 的制药公司对此非常感兴趣。

要点总结

HD 研究的未来在于能够以极高的精度观察细胞和分子的技术。

摘要

• 研究人员正在开发强大的新技术，以前所未有的细节揭示 HD 的生物学机制。
• 长读长测序通过直接读取长 DNA 片段，提供了对 CAG 重复序列及其体细胞扩增的更完整视图。
• 多模态空间转录组学在同一细胞中结合了多种测量，允许研究人员将重复序列扩增、基因活性、亨廷顿蛋白聚集体和细胞健康联系起来。
• 冷冻电子断层扫描在细胞内部创建高分辨率 3D 图像，揭示了传统光学显微镜无法看到的结构变化。
• 单分子光镊允许研究人员一次研究一个亨廷顿蛋白，揭示可能触发毒性的短暂结构变化。
• 荧光激活细胞核分选（FANS）分离出受 HD 影响最严重的脑细胞，使其能够独立于周围细胞进行研究。
• 每项技术都回答了不同的问题，但它们共同提供了关于亨廷顿舞蹈症如何发展和进展的更完整图景。
• 这些进展正在加速当今的基础研究，并可能有助于识别未来的新生物标志物和治疗靶点。